被误认为“逃兵”的管轶教授没有闲着，他的课题组努力寻找新冠病毒的中间宿主，也就是问介于储存宿主蝙蝠和人之间的宿主是什么？这是对于预防新冠病毒再次感染人很有意义的问题。管轶教授实验室新的论文提供更多证据，从多个穿山甲发现多个冠状病毒，与新冠病毒有相似性。这些发现提示穿山甲很可能是中间宿主。有些科学家认同，有些认为证据还不够，甚至认为穿山甲有可能和人一样是受害者之一。无论哪种结论，偷运和食用穿山甲肯定不是好事。
2017年8月，广西陆生野生动物救护研究与疫源疫病监测中心接收走私入境的34只穿山甲，其中32只活体。
图片来源：南国早报”微信公号”
撰文 | 魏玉保 邸利会
编辑 | 陈晓雪
2月18日，香港大学管轶课题组与广西医科大学胡艳玲课题组合作的工作在论文预印网站bioRxiv上发布[1]，表明穿山甲很可能是新冠病毒从蝙蝠到人类的中间宿主。
宏基因组测序确定了与穿山甲相关的冠状病毒，在演化树上属于2019-nCoV（注：国际病毒分类学委员会将引发此次疫情的病毒病名为SARS-CoV-2）相关冠状病毒的两个亚谱系，其中一个谱系在受体结合域中与2019-nCoV密切相关。宏基因组指环境样本或组织样本中全部微生物的基因组。
作者建议，穿山甲冠状病毒的多个谱系与2019-nCoV相似表明，穿山甲应被视为该新型人类病毒的可能中间宿主，应从潮湿的市场中移出以防止人畜共患病传播。
截至目前，穿山甲是除了蝙蝠之外[2]，第二种被确认其身上的冠状病毒与2019-nCoV非常接近的哺乳动物。
此前在1月23日，中科院武汉病毒研究所石正丽团队在bioRxiv发文，表明蝙蝠很可能是2019-nCoV的宿主。(Nature杂志在2月3日正式发表该论文，详见赛先生之前的推送：石正丽最新研究：新冠肺炎患者早期病毒核算量更高)。
管轶实验室曾在2003年SARS爆发时，成功确定了冠状病毒是SARS肺炎的病原体，为防控SARS疫情指明了正确方向。之后他追踪了SARS冠状病毒的传染源来自于城市畜禽市场中的野生动物。
在这篇论文中，管轶等人所用的穿山甲样本为冻存组织，分别来自2017年8月到2018年1月广西海关缴获后，从广西医科大学获得的马来穿山甲（pangolins, Manis javanica）和2018年5月到7月从广西医科大学搜集的穿山甲样本。
除了广西缴获的穿山甲，在2019年新型冠状病毒暴发以后，广州海关技术中心重新检测了他们在2019年3月反走私行动中缴获留存的5个穿山甲样本。高通量的测序发现，鳞片上的样本也有冠状病毒，部分序列与2019-nCoV基因组有72%的相似性。
对此，香港大学管轶教授课题组专家说：“现时并没有科学根据病毒能在鳞片感染和繁殖，所以鳞片上提到核酸序列很大机会来自于旁边的身体组织。我们在文章上也有提及此观点。”
此外，广东省生物资源应用研究所和广州动物园发表于2019年10月的论文表明[3]，穿山甲是冠状病毒的携带者。研究组也获得了这一来源的穿山甲病毒序列的86%。
管轶实验室发现，这些穿山甲冠状病毒序列与人的2019-nCoV序列相似性达到了85.5-92.4%。
需要特别指出的是，在冠状病毒受体结合域（RBD）氨基酸序列，文章提到的广东穿山甲冠状病毒与2019-nCoV的相似度是97%，而蝙蝠冠状病毒RaTG与2019-nCoV相似度则比较低，是89.2%。不过，新冠病毒除了在受体结合域部分和广东的序列有高度氨基酸序列相似外，剩余序列部分是和蝙蝠冠状病毒RaTG13有更为紧密联系。
有趣的是，作者通过深入的比较，发现穿山甲冠状病毒在受体结合区域的非氨基酸编码碱基上与新型冠状病毒差别大，而与蝙蝠病毒RaTG13形成一小组，这在进化上提示穿山甲冠状病毒在这个区域重要氨基酸变化是进化选择的结果，而不是随机的。
作者认为，穿山甲冠状病毒的受体结合域与2019-nCoV之间的氨基酸相似性可能是由于选择性介导的趋同进化而不是重组引起的，尽管很难在当前数据的这些情况之间进行选择。
广东省生物资源应用研究所和广州动物园发表于2019年10月的论文表明[3]，穿山甲是冠状病毒的携带者。另外，华南农业大学2月7日在其官方微信公众号上[4]，透露穿山甲是新型冠状病毒的携带者，但截至目前未见其论文发表。
对于武汉华南水产批发市场中的新冠病毒源流，目前仍不明确。中国疾控中心在1月1日上午在此市场中取得500多份环境样本，武汉病毒所在1月12日取得了约70份样本，这两批样本中均有一定比例的样本是新冠病毒阳性。目前我们缺乏这个市场中动物组织样本的数据。
找到宿主和中间宿主，有助于我们及时切断传播源，更好地防控传染病。2004年年初，管轶通过检测广东省野生动物市场中的病毒情况，帮助政府避免了SARS疫情的再次爆发。管轶在本篇论文中指出，不能排除穿山甲身上的病毒可能来自除了蝙蝠之外的其它哺乳动物。这说明了新冠病毒从动物到人中间环节的复杂性。
马来穿山甲（Manis javanica），又名爪哇穿山甲，主要分布于东南亚。走私及买卖穿山甲是违法行为。但是，每年数以百万计的穿山甲被走私到中国，以作食疗或中药材。走私的起点一般是缅甸、马来西亚等东南亚国家。如今，当地以及中国的的穿山甲种群处于严重濒危状态。全球8种穿山甲均被世界自然保护联盟（IUCN）物种红色目录列入濒危级别以上，中国正在考虑将穿山甲由国家二级保护野生动物提升至国家一级保护动物。
从东南亚到中国的野生动物走私链条已经形成多年[5]，目前我们对于这些野生动物身上的病毒情况及其演化所知甚少。但广东、广西近年来零星发生的冠状病毒感染，表明我们不能掉以轻心。关闭野生动物交易市场，严查野生动物买卖，是时候了！
香港大学李嘉诚医学院教授金冬燕评论说：
很有意思，有提示性，但并没有明确结论说明三种病毒的进化路线。不能说SARS-CoV-2一定来自穿山甲，只能说穿山甲中有类似的病毒。
美国德克萨斯州立大学圣安东尼奥医学中心教授项焰评论说：
这个研究很有意义。他们在走私的穿山甲上面发现了多种新的冠状病毒，和现在的新冠病毒比较接近。虽然现在还无法确定这些穿山甲上的病毒来自于哪里以及这些病毒有没有参与和别的病毒的重组造成现在的新冠病毒，这项研究告诉我们自然界中可能有很多还尚未发现的和新冠病毒类似的病毒，而且穿山甲极有可能和这次新冠病毒的传播有关。
宾夕法尼亚大学医学院微生物学系副研究员李懿泽评论：
这些新发现穿山甲冠状病毒，跟新病毒的同源性不及石正丽发现的一株蝙蝠冠状病毒，因此，从目前的数据看，穿山甲不太可能是新冠状病毒的中间宿主。SARS-CoV-2很有意思的是它比其他亲缘近的病毒多了furin切割位点，它的受体结合区，与整体基因组亲缘更近蝙蝠冠状病毒的相似度还不如整体亲缘更远的穿山甲冠状病毒，如果完全通过自然进化获得这些独特性，非常不可思议。
美国俄亥俄州立大学病毒与新发病原学中心主任刘善虑评论说：
相对DNA病毒而言，RNA病毒的基因组序列变化多端。机制主要有二，一是基因突变，二是基因重组; 这是由RNA病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶在病毒复制过程中不忠实容易错配造成的 – 说得白话一点，就叫基因复制出轨。但RNA病毒重要的基因突变和重组并不是随机的，而是有方向的，有选择的。可以想像，病毒总是朝对它们有利的方向进行突变，这就形成了病毒进化。可以说，目前自然界存在的病毒都是在经过了亿万年的与宿主细胞进行了持续不断的战争而淘汰出来的精华。所以，人类对付这些病毒也多显吃力，包括最近的新型冠状病毒。
这篇文章，以及最近类似的几篇，都表明武汉新型冠状病毒有可能直接来源于穿山甲；但也不排除别的中间宿主。这是一个有趣的发现，因为在病毒膜蛋白的受体结合区域，武汉新型冠状病毒与来自穿山甲里的冠状病毒有超过了97%的同源性。这个数字显然超过任何一株目前已知的冠状病毒，包括武汉病毒所最近分离的谣言中心蝙蝠病毒，RaTG13。有趣的是，作者通过深入的比较，发现穿山甲冠状病毒在受体结合区域的非氨基酸编码碱基上与新型冠状病毒差别大，而与蝙蝠病毒RaTG13形成一小组，这在进化上提示穿山甲冠状病毒在这个区域重要氨基酸变化是进化选择的结果，而不是随机的，其目的之一就是能更高效结合人的受体ACE2，从而达到传染人和在人群中传播的目的。其实这种现象在自然界和病毒学非常普遍，有时甚至是一个氨基酸的变化，就可以引起质的飞跃。这种选择多是来自宿主的免疫压力，使病毒不得不变。
目前没有解决的问题是，武汉新型冠状病毒在膜蛋白有一个特征性的4个氨基酸的连续插入，而这个插入在穿山甲以及目前已知的蝙蝠冠状病毒中都不存在。然而，类似序列在部分人的冠状病毒，包括MERS是存在的，这提示新型冠状病毒可能是穿山甲病毒与人的某些冠状病毒的重组体。我们知道，这个特意性的氨基酸插入一般有利于病膜融合，而增加其感染性，所以新型冠状病毒可能在进化上结合了SARS和其他冠状病毒的某些优势。至于新型冠状病毒的实际毒力和传播性能，以及与SARS病毒的比较，需要进一步研究。
美国NIH研究学者王宇歌评论说：
今天穿山甲的冠状病毒序列终于被公布，SARS-CoV-2的起源有了重大突破，这个发现回答了很多的无端猜疑和传言。我上周说很希望看到穿山甲所携带的病毒基因组及S蛋白结构。现在这两个研究数据终于都公布了。除了我已经评价的McLellan组今天上线的Science的S蛋白结构文章；今天bioRxiv上传了汕头大学-香港大学联合病毒学研究所的preprint文章，报道了在马来西亚穿山甲（Manis javanica）中冠状病毒的鉴定结果。这个研究来自管轶组，采样广西和广东海关在2017年至2019年3月截获的非法贩运的马来西亚穿山甲，所以结果非常客观，它全面回答了病毒起源的诸多猜想。而该研究应用了最新的宏基因组技术，发现穿山甲中的2个冠状病毒亚型与SARS-CoV-2十分相似，其中一个亚型和SARS-CoV-2共有RBD的5个氨基酸残基（http://t.cn/A6hod9GX ）。
研究首先检测了2017年8月至2018年1月从18个马来西亚穿山甲（Manis javanica）中收集的冷冻组织（肺，肠，血液）样品。令人惊讶的是，其RNA-seq显示43个样本中的6个（2个肺组织样品，2个肠道样品，1个肺肠混合物样品，1个血液样品）中存在冠状病毒。研究获得6个完整或接近完整的病毒基因组序列—GX/P1E，GX/P2V，GX/P3B，GX/P4L，GX/P5E和GX/P5L，在进化分析中，发现其与SARS-CoV-2亲缘性很近。这些病毒基因组结构与SARS-CoV-2类似，具有9个开放阅读框。研究进一步应用Vero-E6培养系统分离出了病毒。由于这一实验体系的建立，研究设计出了相关PCR引物，进一步鉴定了2018年5月至7月之间收集的另一批穿山甲样品，在从12只穿山甲中测试的19个样品（9个肠道样品，10个肺组织样品）中，发现3个肺组织样品冠状病毒呈阳性（除了来自广西的动物外，在COVID-19疫情爆发后，广州海关技术中心重新检查了他们在以前的截获的5个储存的穿山甲样品）。
这些新的穿山甲冠状病毒基因组与SARS-CoV-2有约85.5％至92.4％的基因序列同源性，它们形成了两个进化分支（亚型），其中之一（GD/P1L和GDP2S）与SARS-CoV-2密切相关。十分重要的发现是，研究判断穿山甲冠状病毒与著名的蝙蝠冠状病毒RaTG13及SARS-CoV-2三者之间可能发生了重组。SARS-CoV-2与发现的穿山甲冠状病毒S蛋白的受体结合结合域（RBD）具有97.4%氨基酸序列同源性；而RaTG13与SARS-CoV-2的RBD只有89.2%的氨基酸序列同源性。更重要的是，穿山甲冠状病毒和SARS-CoV-2在RBD的5个关键残基上具有相同的氨基酸残基，而RaTG13仅与SARS-CoV-2共享1个氨基酸。这可以参见McLellan组S蛋白结构文章（http://t.cn/A6hxelQU ）。由此作者推测，穿山甲冠状病毒的RBD与SARS-CoV-2之间的氨基酸高度相似性可能是由于自然选择介导的趋同进化而不是重组引起的。
穿山甲是除蝙蝠以外唯一被SARS-CoV-2同类冠状病毒感染的哺乳动物，本研究在穿山甲中发现了2个相关的冠状病毒亚型都与SARS-CoV-2高度同源。这表明这些哺乳动物可能是此类冠状病毒的长期宿主，但也不能排除穿山甲的冠状病毒直接来源于蝙蝠。从东南亚到广西和广东的这条非法野生动物的贩运途径，可能是很多相关病毒传染病的真正来源。因此这一研究提示处理这些动物需要相当谨慎，应严格禁止在畜禽或水产市场中出售它们。
参考文献
1. TTY Lam et al. Identification of 2019-nCoVrelated coronaviruses 1 in Malayan pangolins in southern China. 2.18, 2020.doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.13.945485
2. Peng Zhou et al. Discovery of a novelcoronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and itspotential bat origin. bioRxiv. 1 21, 2020
3. Liu, P. et al. Viral Metagenomics RevealedSendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica).Viruses 11, (2019).
4. 华南农业大学发现穿山甲为新冠病毒潜在中间宿主http://www.bjnews.com.cn/news/2020/02/07/685655.html
5. Heinrich, S. et al. The global traffickingof pangolins: A comprehensive summary of seizures and trafficking routes from2010–2015. Trafficking, 2017.12.15.
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